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禽流感的实验室诊断

1、高致病性禽流感判定标准:

10-1稀释的尿囊液种毒,接种4-6周龄8只易感鸡,每只静脉注射0.2ml。
若6-8只死亡:HPAI
若1-5只死亡:血凝素为H5、H7者需进一步验证
若1-5只死亡:在无胰酶处理条件下可在细胞上生长,则需测定HA相关多肽的氨基酸序列才能确定。

2、病毒的分离与鉴定
分离病毒—>HA检测—>HI检测—>病毒毒力测定

3、血凝试验

在微量反应板的1-12孔均加入0.025mL 生理盐水。
吸取0.025mL抗原加入第l孔,混匀。
稀释。
每孔再加入0.025mL PBS。
每孔均加入0.025mL 1%(V/V)鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)。
振荡混匀,在室温(20℃-25℃)下静置40min后观察结果(如果环境温度太高,可置4℃环境下1hr)。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。
结果判定。将板倾斜,观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝(不流淌)的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位(HAU)。

禽流感实验

4、血凝抑制试验

根据血凝试验结果配制4HAU的病毒抗原。
稀释抗体
加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL,室温(约20℃)静置至少30min。
每孔加入0.025mL的鸡红细胞悬液轻轻混匀,静置约40min。
结果判定

5、检测抗体

比较感染早期与14天后对H5N1AIV的血凝抑制抗体效价,上升4倍即为阳性病例

抗体检测

RT-PCR

RT-PCR

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